PEWARNAAN BAKTERI

Mikrobiologi On the Blog’s

PEWARNAAN DIFERENSIAL

            Salah satu jenis pewarnan bakteri yang tergolong dalam pewarnaan differansial adalah pewarnaan gram. Pewarnaan ini ditemukan oleh seorang ahli baktetiologi Denmark yang bernama Christian Gram yang secara kebetulan menemukan suatu pewarnaan bertingkat yanag dinamakan Pewarnaan Gram.

            Pewarnaan gram memilah bakteri menjadi 2 kelompok, yakni Bakteri Gram Positif dan Bakteri Gram Negatif. Bakteri gram positif berwarna ungu dan bakteri gram negatif berwarna merah. Perbedaan hasil dalam pewarnaan tersebut disebabkan perbedaan struktur, terutama sususnan dinding sel kedua kelompok bakteri tersebut. Karena kemampuaanya membedakan suatu kelompok bakteri tertentu dengan kelompok lainnya, pewranaan gram juga disebut Pewarnaan Diferensial (Waluyo,2008).

Mengapa terdapat perbedaan warna bakteri gram negatif dan bakteri gram positif???

Bakteri gram negatif dan gram bakteri gram positif memiliki susunana dinding sel yanag berbeda. Bakteri gram Negatif memiliki susunan dinding sel yang mengandung lipid, lemek, dan substansi lemak dalam persentase tinggi dan peptidoglikan lebih sedikit serta dinding sel lebih tipis. Sebaliknya, bakteri gram positif memiliki susunan dinding sel yang mengandung lipid, lemak, dan substansi lemak dalam persentase rendah dan lapisan peptidoglikan lebih banyak serta dinding sel lebih tebal.

Menurut Pelczar dan Chan (1988), perbedaan-perbedaan yang nyata dalam komposisi dan struktur dinding sel antara bakteri gram negatif dan bakteri gram positif, diyakini bahwa perbedaan dinding sel itulah yang menyebabkan kedua kelompok bakteri ini memberi respon terhadap perlakuan dan bahan, seperti pada pewarnaan gram dan antibiotik tertentu.

Bagaimana proses penyerapan warna pada pewarnaan gram????

            Selama prosedur pewarnaan, perlakuan dengan etanol (Alkohol) terhadap bakteri gram negatif menyebabkan terekstraksinya lipid sehingga memperbesar daya rembes atau permeabilitas dinding sel bakteri gram negatif. Jadi kompleks Ungu-Yodium yang telah memasuki dindidng sel selama langkah awal pada  proses pewarnaan dapat diekstraksi, sehingga bakteri gram negatif kehilangan warna tersebut. Bakteri gram negatif mengandung peptidoglikan sedikit dan peptidoglikan ini mempunyai ikatan silang yang jauh kuarang ekstensif, sehingga pori-pori cukup besar walaupun telah diberi perlakuan etanol, sehingga dapat menyerap reagen safranin dengan baik sehingga menyebabkan bakteri barwarna merah. Sebaliknya, karena lipidnya rendah, dinding sel bakteri gram positif menjadi terhidrasi selama perlakuan dengan etanol (Alkohol), pori-pori mengecil,  permeabilitas kurang, dan kompleks Ungu- Yodium yang telah telah memasuki dinding sel tidak dapat terekstrasi (tetap berada dalam sel) sehingga menyebabkan bakteri berwarna ungu.

            Dalam proses pelaksanaan pewarnaan gram, kita harus benar-benar teliti dalam unjuk kerja, serta penentukan lama waktu pemberian bahan maupun reagen untuk pewarnaan. Hal ini lah yang menjadi penentu keberhasilan dalam melaksanakan pewarnaan.

PEWARNAAN NEGATIF

Teknik pewarnaan ini berguna untuk menentukan morfologi dan ukuran sel. Berbeda dengan pewarnaan lain, pada pewarnaan negatif, olesan tidak dilakukan pemanasan atau fiksasi pada nyala bunsen maupun perlakuan dengan bahan kimia lainnya. Pewarnaan negatif menyebabkan mikroba kelihatan transparan (tembus pandang) dan tampak jelas terpisah diantara medan yang gelap karena pewarna yang diberikan tidak mampu menenbus sel mikroba. Sehingga mikroba tampak terang pada saat pengamatan.

Waluyo (2008), menjelaskan bahwa tinta yang dipakai dalam pewarnaan negatif adalah negrosin. Berhasil atau tidaknya pewarnaan ini tergabtung pada:

1.      Kaca objek harus benar-benar bersih

2.      Jumlah nigrosin yang digunakan menentukan keberhasilan pewarnaan.

3.      Campuran Mikroorganisme harus digesekkan diatas kaca objek, bukan sekedar didorong.

Kesalahan yang sering dilakukan pada saat pewarnaan Negatif adalah  preparat terlalu tebal atau terlalu tipis. Bila preparat terlalu tabal menyebabkan lingkunagn sekitar bakteri gelap dan mikrobe tidak dapat dibedakan dengan lingkunga sekelilingnya. Sebaliknya, bila preparat terlalu tipis, tidak terjadi kontras yang tajam antara mikrobe dengan lingkungan sekaitar.

“ Hidup ini tidak semudah yang kita bayangkan,,,,,karena tidak ada yang mudah dilalui hanya dengan angan-angan. Lalui hari-hari dengan usaha yang nyata, tidak hanya dengan merenung,,,karena renungan tidak akan mengubah keadaan……..”

bY:

Hendra Budiono, S.Pd

Daftar Pustaka

Pelczar, Jr. M. J., Chan, E.S.C. 1988. Dasar-dasar Mikrobiologi Jilid 2. Terjemahan R.S. Hadioetomo., T. Imas., S. S. Tjitrosomo., S. L. Angka., UI- Press. Jakarta.

Waluyo, L. 2008. Teknik dan Metode Dasar dalam Mikrobiologi. Malang: UMM-Press.

Metode Most Probable Number (MPN)

MPN diartikan sebagai jumlah perkiraan terdekat. Pemeriksaan MPN bertujuan untuk mengetahui adanya bakteri Coliform dan E.coli yang biasanya ditandai dengan terbentuknya gas pada media Lactose Broth (LB) dan pada media Briliant Green Lactose Bile Broth (BGLBB), pemeriksaan ini dapat dilakukan dengan cara sampel ditanam pada media Lactose Broth (LB). Hasil positif gas dipindahkan kedua seri media Briliant Green Lactose Bile Broth (BGLBB), 1 seri ditanam pada suhu 37C (untuk MPN Coliform) dan 1 seri ditanam pada suhu 44C (untuk MPN E.coli). Kemudian diinkubasi selama 24–48 jam, dan dicatat jumlah tabung positif gas. Angka yang diperoleh adalah indeks MPN Coliform untuk suhu 37C dan indeks MPN E.coli untuk suhu 44C (Fardiaz, 1992a:60).

Dalam metode MPN, pengenceran harus dilaksanakan sedemikian rupa sehingga tabung yang berisi medium cair yang diinokulasi dengan larutan hasil pengenceran tersebut mengandung lebih dari satu sel, sedangkan tabung lainnya tidak mengandung sel. Dengan demikian, setelah inkubasi diharapkan terjadi pertumbuhan pada beberapa tabung yang dinyatakan sebagai tabung positif, sedangkan tabung lainnya negatif. Untuk mendapatkan beberapa tabung negatif, pengenceran yang dilakukan dalam metode MPN harus lebih tinggi dibandingkan dengan pengenceran pada metode cawan (Fardiaz, 1993:71).

Nilai MPN adalah perkiraan jumlah unit tumbuh (growth unit) atau unit pembentuk koloni (colony forming unit) dalam sampel. Namun, pada umumnya, nilai MPN juga diartikan sebagai perkiraan jumlah individu bakteri. Satuan yang digunakan, umumnya per 100 ml atau per gram. Misalnya terdapat nilai MPN 10 dalam sebuah sampel, artinya dalam sampel tersebut diperkirakan setidaknya mengandung 10 Coliform pada setiap gramnya. Makin kecil nilai MPN, makin tinggi kualitasnya, dan makin layak dikonsumsi. Metode MPN memiliki limit kepercayaan 95 persen sehingga pada setiap nilai MPN, terdapat jangkauan nilai MPN terendah dan nilai MPN tertinggi (Krisna,2005:1).